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化學合成多肽原料藥的質(zhì)控項目有哪些？

   ---化學合成多肽原料藥的質(zhì)量研究

    合成多肽原料藥的質(zhì)量研究除參考小分子化學藥物的研究思路進行常規(guī)項目的研究外，還應根據(jù)合成多肽的制備工藝、結構和理化特性等增加一些特定的考察項目，例如氨基酸組成分析、反離子含量等。表3列舉了合成多肽原料藥的質(zhì)控項目作為參考,僅作為示例展示，并不代表全部情況，應根據(jù)產(chǎn)品特性擬定具體考察項目。

表1 合成多肽原料藥的質(zhì)控項目

檢查項	注釋
鑒別
高效液相色譜(HPLC)	供試品溶液與對照品溶液主峰的保留時間一致，推薦采用等劑量混合進樣，應得到單峰
質(zhì)譜(MS)	應在理論值(單同位素分子量或平均分子量)+1.0 Da范圍內(nèi)，大于2kDa的多肽建議使用高分辨率儀器
氨基酸組成分析(AAA)	應明確水解和衍生化方法
檢查
氨基酸比值	應明確水解、衍生化方法和計算方法，需開展方法學驗證
反離子含量	應明確是否存在反離子;根據(jù)多肽藥物結構中的理論反離子含量在質(zhì)量標準中擬定合理的上下限范圍
肽相關雜質(zhì)(或稱有關物質(zhì))	應采用雜質(zhì)對照品進行方法學驗證(如工藝雜質(zhì)、降解雜質(zhì)、差向肽雜質(zhì)等)，關注方法的專屬性
殘留溶劑	重點關注生產(chǎn)過程中接近終產(chǎn)品工藝步驟所用到的溶劑
元素雜質(zhì)	參考ICH Q3D根據(jù)風險評估結果對可能引入的元素雜質(zhì)進行控制
水分	多肽通常具有引濕性，水分可能顯著影響藥物的含量和穩(wěn)定性，應根據(jù)開發(fā)過程和穩(wěn)定性考察的歷史批次數(shù)據(jù)在質(zhì)量標準中設定水分的可接受標準。
含量測定
高效液相色譜(HPLC)	可參考有關物質(zhì)1鑒別方法(與對照品比較)

注:注射用原料藥建議對微生物限度和細菌內(nèi)毒素進行研究。

1、鑒別
    多肽藥物的鑒別方法應具有專屬性，通常采用反相高效液相色譜(RP-HPLC)和質(zhì)譜法(MS)。此外，還可考慮使用氨基酸組成分析(AAA)、肽圖分析或核磁共振波譜(NMR)等不同原理的鑒別方法進行正交確認。

2、氨基酸比值
    氨基酸分析數(shù)據(jù)可用于計算多肽藥物的氨基酸比值。氨基酸分析的水解方法可參考相關技術指南進行。通常選擇在水解處理中穩(wěn)定的氨基酸用于多肽的定量研究，此類氨基酸主要有門冬氨酸或門冬酰胺、谷氨酸或谷氨酰胺、丙氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸和精氨酸?？筛鶕?jù)多肽藥物的氨基酸序列及不同氨基酸測定方法調(diào)整用于定量研究的氨基酸種類。需明確氨基酸比值水解方法和計算方法，同時，應進行相應的分析方法驗證工作，證明方法的適用性。

3、雜質(zhì)

根據(jù)化學合成多肽藥物的雜質(zhì)特點，可將其分為肽相關雜質(zhì)和非肽雜質(zhì)。
     (1)肽相關雜質(zhì)
      肽相關雜質(zhì)(或稱有關物質(zhì))是指與目標分子結構有關.的雜質(zhì)，是反映多肽化學純度的重要指標之一。肽相關雜質(zhì)可由起始物料引入、生產(chǎn)工藝副反應或長期放置過程中降解產(chǎn)生。表4列舉了肽相關雜質(zhì)的常見類別及來源，僅作為常見示例展示，并不能代表全部情況，應結合產(chǎn)品特性進行評估和分析。

表2 肽相關雜質(zhì)的類別及來源

              

    由于部分肽相關雜質(zhì)的結構、性質(zhì)與主成分較為相似，采用單一原理的分析方法可能無法完全分離，推薦采用多種不同原理的檢測方法進行有關物質(zhì)檢查。有關物質(zhì)檢查方法除常見的高效液相色譜外，還可考慮使用離子交換色譜、毛細管電泳法等。聚合物檢查可采用分子排阻色譜、聚丙烯酰胺凝膠電泳法等。
    差向肽類雜質(zhì)的色譜行為多與主成分非常接近，鑒定和分離難度大。可使用氘代試劑水解多肽(例如氯化氘(DCI)/氘代水(D2O)) ，采用Marfey試劑(FDAA) 、鄰苯二甲醛(OPA)或三氟乙酸酐(TFAA) 等對水解后的氨基酸進行衍生，采用相應檢測手段測定每個氨基酸手性異構體的含量，判斷出肽鏈中易發(fā)生消旋的氨基酸，進一步制備相應的異構體雜質(zhì)對照品進行針對性研究。

有關物質(zhì)檢查方法學驗證過程中應重點關注專屬性問題，可選擇與目標肽結構相近的工藝雜質(zhì)和降解雜質(zhì)對照品進行分離度考察，或采用多肽粗品和強制降解試驗樣品檢驗主峰峰純度。由于多肽一般為末端吸收，采用DAD檢測器無法有效反映峰純度，可采用液質(zhì)聯(lián)用等方法對主峰峰純度進行研究。結合有關物質(zhì)項目中確定的特定雜質(zhì)，采用相應的雜質(zhì)對照品進行全面的方法學驗證。
    本指導原則將肽相關雜質(zhì)的報告限、鑒定限和質(zhì)控限分別制定為0.1%、0.5%和1.0%。 如發(fā)現(xiàn)多肽藥物雜質(zhì)存在安全性隱患，應適當收緊雜質(zhì)限度要求。

    (2)非肽雜質(zhì)
    非肽雜質(zhì)是工藝過程中引入的與目標分子結構不相關的雜質(zhì)，包括反應試劑和溶劑、金屬催化劑、縮合劑等殘留物,此類雜質(zhì)的研究可參照小分子化學藥物相關指導原則進行。多肽藥物在合成過程中，需使用不同類型的縮合劑、保護基團等，此類物質(zhì)在反應過程中可能生成含有警示結構的小分子副產(chǎn)物。應制定合理的控制策略，例如，可采用具有代表性的化合物或接近終產(chǎn)品工藝步驟生成的化合物進行針對性的清除效力研究，以證明采用的分離純化方式可有效去除相應雜質(zhì)。

4、含量測定
    含量測定是評價多肽質(zhì)量的重要指標之一，通常在無水、無反離子的基礎上進行研究。-般可采用HPLC法，通過與對照品進行比較，得到目標多肽占總物質(zhì)的百分比。若經(jīng)充分的方法學驗證，也可采用其他原理的分析方法。